【OPUD-277】食糞アナル拷姦 ～リストラ社員の糞拷問～ 神崎まゆみ 大肠埃希氏菌计数步伐

一、大肠埃希氏菌简介 【OPUD-277】食糞アナル拷姦 ～リストラ社員の糞拷問～ 神崎まゆみ

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  大肠埃希氏菌（Escherichia coli）又称大肠杆菌，平常存在于东说念主和温血动物的肠说念中，或者在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP践诺、柠檬酸盐）生化践诺后果为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此看成粪便玷辱策动来评价食物的卫生景况，预计食物中肠说念致病菌玷辱的可能性。

二、参考标准

  《GB 4789.38-2012 食物安寰宇度标准 食物微生物学考试 大肠埃希氏菌计数》。

三、考试经过

  （一）MPN法

图1 大肠埃希氏菌MPN计数法考试形式

  1.初发酵践诺

  每个样品，遴荐3个合适的畅达稀释度的样品匀液（液体样品不错遴荐原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰卵白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量朝上1mL，则用双料LST肉汤），36±1℃培养24±2h，不雅察小倒管内是否有气泡产生，24±2h产气者进行复发酵践诺，如未产气则接续培养48±2h。产气者进行复发酵践诺。如所有这个词LST肉汤管均未产气，即可敷陈大肠埃希氏菌MPN后果。

  左证标准菌株对月桂基硫酸盐胰卵白胨（LST）肉汤进行考证。大肠菌群、大肠杆菌和发酵乳糖的革兰氏阴性细菌产不悦体，在小倒管内有气泡；其它细菌无气泡。后果如图2所示：

a:鼠伤寒梵衲氏菌 b:大肠埃希氏菌 c:弗氏柠檬酸杆菌 d:暗沟肠杆菌 e:粪肠球菌 f:空缺对照

图2 月桂基硫酸盐胰卵白胨（LST）肉汤微生物资控后果

  2.复发酵践诺

  用接种环从产气的LST肉汤管平差别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24±2h，查验小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则接续培养至48±2h。记载在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有这个词EC肉汤管均未产气，即可敷陈大肠埃希氏菌MPN后果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。

  左证标准菌株对EC肉汤进行考证。粪大肠菌群和大肠杆菌产不悦体，在倒立小发酵管中有气泡。后果如图3所示：

a:大肠埃希氏菌菌 b:鼠伤寒梵衲氏菌 c:弗氏柠檬酸杆菌 d:暗沟肠杆菌 e:肺炎克雷伯氏菌 f:空缺对照

图3 EC肉汤微生物资控后果

  3.伊红好意思蓝（EMB）平板分离培养

  轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物差别划线接种于EMB平板，36±1℃培养18～24h。不雅察平板上有无具玄色中心有晴明或无晴明的典型菌落。           

  左证标准菌株对EMB培养基进行考证。典型大肠埃希氏菌菌落特征为具玄色中心有金属晴明，产气肠杆菌为粉红色菌落无晴明，鼠伤寒梵衲氏菌为无色菌落。后果如图4所示：

a:大肠埃希氏菌 b:产气肠杆菌 c:鼠伤寒梵衲氏菌

图4 EMB培养基微生物资控后果

  4.革兰氏染色

  挑取养分琼脂培养基上的纯培养的单个可疑菌落，进行革兰氏染色。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，呈红色杆状。后果如图5所示：

图5 大肠埃希氏菌的革兰氏染色后果

  5.生化轻视

  取培养物进行靛基质践诺、甲基红践诺、VP践诺和柠檬酸盐诓骗践诺，可录取使用大肠杆菌生化轻视条进行生化轻视，大肠埃希氏菌的生化响应后果为靛基质阳性、甲基红阳性、VP阴性、柠檬酸盐阴性。如图6所示：

图6 大肠埃希氏菌生化轻视条践诺后果

  6.后果判定

  大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化践诺为＋＋--或-＋--。惟有有1个菌落轻视为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表，敷陈每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。

  （二）平板计数法

图7 大肠埃希氏菌平板计数法考试形式

  1.平板计数

  取2～3个合适的畅达稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿， 每皿1mL。同期取1mL稀释液加入无菌平皿作念空缺对照。

  将10～15 mL 冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。注重旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3～4 mL VRBA-MUG隐私平板上层。凝固后翻转平板，36±1℃培养18～24 h。

  左证标准菌株对VRBA培养基进行考证，大肠埃希氏菌为紫红色菌落，有胆盐千里淀环；在紫外灯映照下有荧光。后果如图8所示：

a;大肠埃希氏菌 b;弗氏柠檬酸杆菌 c;暗沟肠杆菌

图8 VRBA培养基微生物资控后果

  放心事项：遴荐菌落数在10～100CFU之间的平板，暗室中360～366nm波长紫外灯映照下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。

  2.后果判定

  两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，敷陈每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)示意。若所有这个词稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落滋长，则以小于1乘以最低稀释倍数敷陈。

  

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